Zpět na výběr čísla
Zpět na Home page


Obsah 10/99

Odborné aktuality

Překročena hranice šesti miliard
5. výročí založení sekce enzymoterapie Společnosti všeobecného lékařství ČLS JEP
České zdravotnictví – šance a rizika III
Hrozí další drogový boom?

Věda pro praxi

Populační studie chronické bolesti
BMI (body-mass index) optimální pro dlouhověkost
CC7- CLINICAL CARE kvalitní britská kosmetika pod vánočním stromečkem
Botulismus – současný pohled na vstřebávání a účinky toxinu
Možnosti prevence karcinomu pankreatu jsou omezené
Význam eradikace helikobaktera při neulcerativní dyspepsii je sporný
Psychologie ovlivňuje progresi nádorového onemocnění
Absorpce perorálně podaných proteolytických enzymů – nové výsledky

Farmakoterapie / Farmacie

Podpora perorálnímu podávání vitaminu B12
Rakouský projekt antibiotické strategie
Pentoxifylin v léčbě bércových vředů

Gynekologie

Premenstruační syndrom – zjevný biologický podklad
Kontroverzní názory na kontraceptiva třetí generace
Mezinárodní kongres Kontroverze v gynekologii, porodnictví a léčbě sterility
Příčinou 48% případů SIDS je kouření matky v těhotenství

Kardiovaskulární choroby

S prevencí aterosklerózy je třeba začít už před porodem?
Studie DASH – dietou proti hypertenzi
Inovace doporučených postupů při léčbě TIA
Preventivní dieta po infarktu myokardu

Infekční choroby

Je rekurentní tuberkulóza důsledkem exogenní infekce?
Herpesviry v těhotenství
Mechanizmus ničení řasinkového epitelu při pertusi
Hypokalémie – podceňované riziko
Nehospitalizované pneumonie

Pediatrie

Terapeutické možnosti v pediatrii – léčba závažných infekcí

Neurologie

Tiky a tiková nemoc
Antibiotika a léčivé rostliny

Manažerem vlastního zdraví

Diskuse o samoléčení pokračuje
„Klid na lůžku“ může přinést více škody, než užitku
Pojídání jogurtu a imunita
Antibiotika a léčivé rostliny

Systémová enzymoterapie

Komplexní mechanismy účinků SET a jejich vliv na cévní řečiště
Vliv SET na některé etiologické faktory cévních onemocnění a experimentální modely

Imunologie dnes

Pasivní imunoterapie – II. Využití v onkologii a imunologii

Počítače v medicíně

Rok 2000 na našem počítači - důvod k panice?
Jak zjistit a nastavit datum a čas

www servis

Helicobacter & anemie...
HDL-cholesterol...
Po mrtvici- irskou kávu..?
Máte doma defibrilátor..?
Kojení...
Interleukin a KVCh...
Geny & Ca prostaty...
Deficit vitaminu B...
Detoxifikace...
Poškození míchy...
Samostatné myocyty...
Karcinom prsu...
Onkologie...
Genetický kurs...
Nová forma detoxifikace..?
Kuřáci, jezte zdravě..!
Doppler...
Cévní náhrady...
Angiogeneze...
Angiogeneze 2...
Kouření – prostá věc..?
Schizofrenie...
SSRI & PMS - změna..?

Inzerce

Zpráva ze sympozia s mezinárodní účastí na téma - Multidisciplinární léčba bolestivých a zánětlivých stavů
Řádková inzerce

l_med.gif (3046 bytes)

IMUNOLOGIE DNES / 25. 11. 1999 / STRANA 22, 23 / MEDICÍNA 10 / VI

Pasivní imunoterapie – II. Využití v onkologii a imunologii

MUDr. Karel Nouza, DrSc., Ústav pro péči o matku a dítě, Praha 4
MUDr. Martin Nouza, Csc., Klinika dr. Svobody, Praha 1.

Diagnostické využití protinádorových protilátek

Pokusy o diagnostické využití„označkovaných“ protinádorových protilátek k lokalizaci zhoubných nádorů a metastáz jsou staršího data. Výsledky dosahované zvířecími i lidskými séry a imunoglobuliny nebyly však plně uspokojivé. Takové protilátky totiž nejen nádorové a s nádorem sdružené znaky, ale i širokou paletu různých dalších buněčných i nebuněčných znaků a jejich soustředění do nádorů je nízké a velmi nestandartní. Dnes jsou ovšem k dispozici myší, humanizované i lidské monoklonální protilátky (MP) proti různým nádorovým a s nádory sdruženým znakům, jejichž soustřeďování do nádoru je poměrně selektivní. Pokud se pak na takové protilátky navážou vhodné „značky“ – většinou izotopy jódu, technecia a dalších prvků – lze získat dosti přesné scintigrafické obrazy nádorových ložisek.

Např. „Oncoscint“ k detekci kolorektálního a ovariálního karcinomu je vybaven 99mTc (Larson 1995). Americká FDA nedávno schválila používání označkované MP proti CEA (Arcitumomab) pro lokalizaci ložisek a metastáz karcinomu tlustého střeva. Táž protilátka je vhodná i pro diagnostiku karcinomu mammy (Goldenberg a Nabi 1999).

Diagnostické využití protilátek je ve skutečnosti širší: umožňují např. kvantifikovat nádorové znaky (antigeny) v krvi a výpotcích, klasifikovat nádorové procesy krvetvorného a lymfoidního systému a určovat histogenetický původ zhoubného procesu.

čebné využití protinádorových protilátek

Už na začátku 20. století byly zahájeny pokusy ovlivnit protilátkami příznivě průběh zhoubných nádorů. Nejen séra cíleně imunizovaných zvířat, ale ani séra od nemocných s analogickým nádorem, blízkých příbuzných a dobrovolníků neprojevila však očekávanou účinnost: podané materiály se v těle nemocných distribuovaly bez preference pro nádor. Cizí séra navíc vyvolávala rychlou a silnou neutralizační odpověď a často i reakce z přecitlivělosti.

Zásadní obrat přinesla až příprava monoklonálních protilátek proti specifickým nádorovým nebo s nádory sdruženým znakům (antigenům). Dlouho převládalo používání MP myšího původu, v poslední době však byly postupně připraveny chimérické, humanizované a zcela lidské produkty.

Vhodné MP lze získat v prakticky neomezeném množství a proto byly před zhruba 10 lety zahájeny pokusy využít je v klinické léčbě. Proti konvenčním protilátkám se selektivněji soustřeďují k volným nádorovým buňkám i do nádorů, kde podle svých vlastností opsonizují, aktivují komplement nebo zapojují zabíječské „K“ buňky.

Výsledky ukázaly, že pozitivní odpověď lze očekávat především u některých leukémií a T i B lymfomů, zatímco u solidních nádorů jsou odpovědi variabilní a méně výrazné. Jedním z důvodů je rozptylování MP po celém organismu (velké množství např. zadrží fagocyty jater a plic), takže do nádoru proniká pouze 0,01 a maximálně 7% podaného množství. Probíhají proto pokusy o omezení funkcí fagocytů a o úpravy MP (např. odstranění nebo modifikace Fc oblasti). Problém heterogennosti subpopulací nádorových buněk a proměnlivosti jejich povrchové výbavy by mohl být řešen podáním několika protilátek proti hlavním epitopům.

Příkladem může být studie Riethmüllera et al. (1994): Ze 189 nemocných s kolorektálním karcinomem dostávala polovina ihned po operaci a po následné 4 měsíce infúze MP proti znaku 17-1A. Proti kontrolní polovině bez léčby MP pozorovali autoři v průběhu 5 let o 27% nižší výskyt relapsů o 30% nižší úmrtnost.

Imunotoxiny

Některé problémy celkové radioterapie a chemoterapie vyplývají z jejich semiselektivního zásahu a z toho vyplývajícího častého poškození normálních tkání. Tomu by se mohla vyhnout směrovaná léčba schopná selektivnějšího působení na nádorové buňky. Zvládnutí „high-tec“ přípravy MP umožnilo přípravu imunotoxinů (ITOX), v nichž MP slouží jako směrovací složky. Dalšími směrovacími jednotkami mohou být růstové faktory nebo cytokiny, pro něž vyjadřují terčové buňky specifické receptory.

Maximum využití léčebných ITOX se očekává v onkologii, ale perspektivní je i používání v dalších medicínských oblastech. U autoimunitních onemocnění nabízejí ITOX možnost potlačit selektivně pouze patologické klony (většinou T) buněk. V transplantační léčbě slouží ITOX k potlačení vypuzovací reakce proti orgánu či k omezení reakce štěpu proti hostiteli po převodu kostní dřeně. Zajímavou možností je i likvidace HIV infikovaných T lymfocytů.

Cytotoxické působky

Zprvu byly používány radionuklidy, především izotopy jódu (125I a 131I) a dalších prvků. V poslední době se dává přednost 67Cu (de Nardo et al. 1999). Vyzkoušeny byly i cytotoxické proteázy, RNAázy z lidských eozinofilů a DNAázy.

Dnes jsou nejčastěji využívány bakteriální toxiny, např. pseudomonádový a difteriový, z rostlinných např. ricin nebo abrin (méně často modeccin, viscumin, protein z pokeweedu – líčidla, saporin, gelonin, momoridin, trichosantin). Z toxinů hub lze použít alfa-sarcin či restriktocin.

Toxiny jsou před použitím zbaveny vnitřní vazebné domény (nebo je tato doména modifikována), a nesou „blokující“ jednotku, která je stálá v oběhu, ale labilní uvnitř buněk. Toxiny jsou velice účinné. Protože pracují na kytalytickém principu (jsou schopny reagovat opakovaně s různými terčovými nitrobuněčnými strukturami) může buňku usmrtit i méně něž 10 molekul proniknuvších do cytosolu. Navíc na rozdíl od chemoterapeutik jsou toxiny schopny zlikvidovat nejen dělící se, ale i klidové (spící) nádorové buňky.

Všechny typy toxinů zabíjejí buňky inhibicí proteosyntézy – obvykle indukcí apoptózy cestou aktivace kaspáz. Četné modifikace směřují k optimalizaci ITOX. Např. kombinace rostlinného a bakteriálního toxinu zvyšuje cytotoxickou aktivitu 100x až 1000x.

Faktory ovlivňující vlastnosti ITOX

Cytotoxicitu ITOX ovlivňuje především vazebná afinita směrovací jednotky a hustota terčových buněčných antigenů. Ligandy s nízkou vazebnou afinitou nebo vázající se na řídce vyjádřené antigeny vyžadují k usmrcení buňky až 104 krát více ITOX. Rozhoduje i umístění antigenních epitopů a jejich schopnost internalizace. Po internalizaci ITOX rozhoduje o účinnosti nitrobuněčná cesta. Nevhodný je časný přesun do lyzosomů, kde je toxin degradován, naopak výhodný je přesun do Golgiho aparátu (typický pro rostlinné toxiny).

V cestě dosažení žádaného efektu ITOX stojí – stejně jako v léčbě samotnými protinádorovými protilátkami – řada překážek : patří k nim nežádoucí imunogennost směrovacích i toxických složek, nespecifická toxicita, nedostatečná koncentrace v terčových oblastech, nedostatečná internalizace do buněk a ne zcela vhodná nitrobuněčná distribuce.

Cílová složka

V případě ITOX určených k protinádorovému působení jsou optimálními terči pro nádor specifické nebo s nádorem sdružené antigeny, jindy diferenciační antigeny společné normálním i nádorovým buňkám, pokud jejich exprese na nádorových buňkách je výrazně vyšší.

Nežádoucí je vznik odolnosti nádorových buněk původně vnímavých na ITOX, způsobený mutačními změnami v expresi terčových antigenů, poruchami v internalizaci a změnami v nitrobuněčných přesunech. Zde mohou pomoci „koktejly“ několika ITOX.

Z uvedeného důvodu pokládají někteří autoři za výhodnější „terče“ endotelové buňky (EC) cév zásobujících nádor. V tomto případě odpadá problém heterogennosti a proměnlivosti nádorových buněk (antigenní výbava EC nepodléhá mutačním změnám, a navíc vyjadřují některé specifické aktivační znaky, např. endoglin, endosialin ad.). K zániku všech nádorových elementů by zde došlo nedostatkem živin a kyslíku. Pozitivní výsledky byly v experimentech dosaženy jak MP a ITOX proti antigenům EC, tak proti jejich růstovému faktoru (Kanai et al. 1998).

Nádorové B a T buňky obvykle exprimují hodně diferenciačních antigenů, a případné poškození normálních lymfocytů může být snadno nahrazeno z poolu kmenových buněk.

Pro zásah maligních B lymfocytů v případě lymfomů z B buněk jsou vhodné MP směrované ITOX proti znakům CD19 a CD22, pro zásah buněk akutní leukémie proti znaku CD7. Myeloidní leukemické buňky lze zasáhnou ITOX proti CD33, Reed-Sternbergovy buňky Hodgkinova lymfomu ITOX proti CD30. Při léčbě melanomů je vhodným terčem gp 240 (který je vyjádřen v 80% případů), při léčbě ca kolon a ovaria gp 72.

K zásahu autoimunitních T lymfocytů a T lymfocytů operujících v GVHR byly připraveny ITOX proti CD3, CD2, CD4, CD5, CD7, CD11a, CD18 a CD25.

Terčovými strukturami pro ITOX směrované cytokinymohou být receptory pro IL-2 (IL-2R)- (lymfomy, autoimunitní choroby, AIDS), IL-4R (lymfomy, různé nádory), IL-6R (myelomy, hepatomy, Kaposiho sarkomy), IL-7R (lymfomy, leukemie), IL-9R (Hodgkinova nemoc, lymfomy), IL-15R (lymfomy, leukemie), EGFR (různé nádory), receptory pro melanotropin (melanomy), receptory pro GM-CSF (lymfomy, leukemie) ad.

Klinické studie

Experimentální studie, prováděné nověji hlavně na nu/nu myších a těžce imunosuprimovaných myších nesoucích štěpy lidských nádorů, naznačují, že uspokojivé výsledky léčby ITOX mohou být dosaženy i jedním intenzivním cyklem terapie MP nebo ITOX, ale jen u nemocných s maligním procesem z volných buněk (leukemie, některé lymfomy) nebo s premaligním, „spícím“ či minimálním (zbytkovým) solidním nádorem. V studiích I. fáze byla ovšem prověřována bezpečnost léčby u nemocných s rozsáhlým neovlivnitelným procesem. Teprve po zjištění přijatelné imunogennosti, absence závažných vedlejších účinků, příznivé farmakokinetiky a po stanovení maximální snášené dávky bylo přikročeno ke studiím II. fáze u nemocných s méně pokročilým onemocněním. Přistoupit ke studiím III. fáze je pak možné pouze tehdy, zjistí-li se zřejmá pozitivní odpověď (20 - 40% částečných nebo úplných remisí). Dnes probíhá většina studií ve II. fázi a několik přestoupilo do III. fáze.

V roce 1996 (Thrush et al.) byly k dispozici studie s ITOX u metastazujícího melanomu (3), kolorektálního karcinomu (1), karcinomu mléčné žlázy (2), karcinomu ovaria (1), Hodgkinovy nemoci (3), nehodgkinského lymfomu (6), B CLL (1), lymfomu z T buněk (1), mozkového tumoru (1), malobuněčné plicní rakoviny (1).
Probíhaly ovšem mnohé další, nap
ř. u karcinomu prostaty a u neuroblastomu.

V osmi nezávislých studiích I. fáze se zřejmá pozitivní odpověď nemocných s maligními nádory projevila u 12% až 75%. To je mnohem více než lze dosáhnout chemoterapeutiky – 90% chemoterapeutik vyvolá výraznou odpověď jen v 5% (Byers a Baldwin 1988).

V polovině 90. let se pracovníkům amerického NCI osvědčily ITOX proti znaku Lewis-Y u nemocných ca colon a prsu (Pai a Pastan 1996). V roce 1998 schválila pak FDA na základě kladných výsledků klinických studií RITUXAN, nekonjugovanou chimérickou protilátku proti CD20 pro léčbu nehodgkinských lymfomů. K registraci byly připraveny i tyto protilátky nesoucí izotop či toxin (Maloney a Press 1998). Probíhají také studie s ITOX proti CD30 u m. Hodgkin a s ITOX proti p80 u osteosarkomů.

MP ITOX proti epitelovému mucinu vybavený 125I je vhodný pro léčbu karcinomu močového měchýře (Sirigos et al. 1999), 131I MP ITOX proti tenascinu prokázal po nitronádorových aplikacích „slibné výsledky“ u 111 nemocných s maligními gliomy (Riva et al. 1999), 131I MP ITOX proti CEA ovlivnil příznivě polovinu z 15 nemocných s metastazujícím karcinomem štítné žlázy (Juweid et al. 1999), ITOX s chimérickou MP proti G250 vybavený 125I působil příznivě u nemocných s karcinomem ledvin (Steffens et al. 1999).

Imunomodulační působení pasivní imunoterapie

Systémová aplikace vysokých dávek imunoglobulinů se stále častěji využívá jako imunomodulační působek. Nejdéle je známo příznivé preventivní a léčebné působení specifických antisér na patologickou izoimunizaci v systému Rh/D, polyklonální Ig se osvědčují u akutních a chronických trombocytopenií, myasthenia gravis, autoimunitních koagulopatií a leukocytopenií, u revmatoidní artritidy, juvenilního diabetu, vaskulitid (Kawasakiho nemoci), neuromuskulárních onemocnění, při opakovaném autoimunitním i aloimunitním potrácení.

Další rozvoj umožnilo zavedení monoklonálních protilátek (MP).

Klinicky se osvědčily MP proti znakům T lymfocytů – především CD4 (u revmatoidní artritidy, vaskulitid, mnohotné sklerózy, na insulinu závislého diabetu, Crohnovy nemoci, těžké psoriázy, v prevenci i léčbě GVHR po transplantaci kostní dřeně, při transplantaci ledvin a dalších orgánů).

Účinnost se připisuje i MP proti TNFalfa (revmatoidní artritida, Crohnova choroba), proti IL-12 (revmatoidní artritida, Crohnova choroba), proti IL-1 (viz MEDICINA V, č.11, 1998) a proti významným adhezním molekulám, např. LFA-1 (transplantace kostní dřeně), a proti integrinům (anti-alfa4 beta 7 se zkouší u Crohnovy nemoci). Jako zajímavá se ukazuje MP anti- CD18 omezující výstup leukocytů do zánětlivého ložiska: mohla by omezit následky mozkové příhody či infarktu a dalších situací, při nichž zánět poškozuje životně důležité tkáně.

Nejnověji se uvažuje o využití u astmatu a dalších alergických onemocnění. V experimentech snížila MP proti IL-5 eozinofilii i bronchální hyperreaktivitu, humanizovaná MP proti IgE přestoupila do II. fáze klinické studie.

Podobně jsou využívány i imunotoxiny (ITOX) směrované proti klidovým a aktivovaným T lymfocytům. Byly získány zkušenosti u revmatoidní artritidy (RA), na inzulinu závislého diabetu (IDDM), SLE, a na základě výsledků na vhodném experimentálním modelu (EAE) i u mnohotné sklerózy.

V prvních dvou klinických studiích I. fáze u RA (Strand et al. 1993) byl použit ITOX proti CD5. Došlo k 50% snížení kloubních bolestí a otoků. Ve studii II. fáze byla po 1 měsíci zaznamenána výrazná pozitivní odpověď, jež u 25% nemocných přetrvávala i po 6 měsících. Celková imunitní reaktivita při tom nebyla narušena. Podobný či ještě výraznější efekt v regresi chorobných symptomů prokázal už dříve ITOX zaměřený proti IL-R2 (Sewel a Trentham 1991). V poslední době se daří pomocí protilátek proti CD4 a CAMPATH-1H prodloužit období remise a převést T lymfocyty do tolerantního stavu. Nadějná se ukazuje i kombinace s protilátkou proti TNF či proti solubilnímu TNFR kombinovanému s Fc IgG1. Další zprávy ukazují výrazný a dlouhodobý efekt i u mnohotné sklerózy (Hale a Cobbolt 1998).

Hodnocení efektu ITOX proti CD5 u nemocných s SLE a u IDDM vyznělo rovněž velmi pozitivně (Stafford et al. 1994). U IDDM projevil účinnost ITOX proti ILR2. Ten se osvědčil i v léčbě těžké psoriázy, především v kombinaci s CAMPATH -1H. Kombinace se ukázala účinnou i u některých vaskulitid, např. Wegenerovy granulomatózy (Estis et al. 1995).

Tolerance léčby byla uspokojivá, z vedlejších příznaků došlo často ke zvýšení teploty a koncentrací transamináz.

Transplantační komplikace

Reakce štěpu proti hostiteli(GVHR) představuje dosud hlavní problém transplantací alogenní kostní dřeně nemocným leukemiemi a lymfomy po ovlivnění supraletálními dávkami chemoterapie. ITOXy (směrované MP či cytokiny proti CD3, CD5 resp. IL-2R), namířené proti T lymfocytům zodpovědným za reakci se osvědčily jak při aplikaci po transplantaci, tak před výskytem před prvních známek GVHR (Martin et al. 1988 Laurent a Bouloux 1992).

Omezení výskytu GVHR bylo pozorováno po ITOX anti-CD5 i u příjemců HLAtotožné nepříbuzenecké dřeně. Nověji jsou používány plně humanizované protilátky proti CD3 (Hall a Cobbolt 1998). Přinášejí výborné klinické výsledky: u GVHR rezistentní na kortikoidy bylo pozorováno až 28% kompletních remisí.

Hlavní komplikací léčby ITOX je (reverzibilní) myelotoxicita, syndrom podmíněný „prosakováním“ cév (vascular leak), a vyšší vnímavost na virové infekce (jež si několikrát vyžádala podávání IL-3). Současné zkušenosti opírající se o 2 300 pacientů ukazují nejen vysokou účinnost, ale i bezpečnost, umožňující rozšířit transplantace kostní dřeně i na méně „ideální“ dvojice příjemců a dárců (Hale a Cobbold 1998).

Infekce HIV a AIDS

V pokusech o ovlivnění HIV infekce byly nejčastěji použity MP a ITOX proti CD4, protože infikované elementy jsou mnohem citlivější (Ghetie et al. 1991). Účinnost projevil i ITOX, v němž směrovací jednotku představovalo solubilní CD4. Méně spolehlivými terči se ukázaly gp160, gp120 a gp 41, podobně jako ITOX proti znakům aktivovaných infikovaných T buněk, např. alfa řetězci IL-2R (CD25).

Vedlejší účinky léčby ITOX jsou zcela odlišné od účinků záření a chemoterapie. Zatímco ITOX obecně nepoškozují rychle se dělící normální tkáně, některé preparáty s ricinem působily hepatotoxicky, nebo vyvolávaly syndrom z cévního prosakování a myalgie. Na druhé straně i mnohotné cykly léčby byly dobře snášeny, což nenasvědčuje kumulaci toxicity.

Závěr

Pokrok genetických a biologických technologií umožnil sestrojit ITOX schopné usmrcovat nejrůznější typy buněk. Nově připravené působky mají sníženou imunogennost a vystupňované protinádorové působení s nízkými toxickými projevy. Stále se objevují nové modifikace: např S.Y. Chen (1999) doporučuje využít pro léčbu solidních nádorů jako nosiče ITOX LAK či TIL buňky. Ukazuje se, že takové produkty mají nejen vyšší protinádorovou aktivitu, ale i prodloužené trvání účinku. Výsledky klinických pokusů II. a III. fáze přinášejí slibné výsledky. Výhledově představují optimalizované preparáty metodu léčebné volby, především při léčbě leukemií a lymfomů a zbytkového „minimálního“ nádorového procesu a při léčbě vůči munosupresi rezistentních autoimunitních procesů.

Nepřetržitost „návratů“ dokládají studie izraelských badatelů Y. Shoenfelda a P. Fishmana, publikované letos v „International Immunology“ (Vol.11, No.8, 1247-1252, 1999). Komerční Ig ze směsné plazmy získané od 15 000 zdravých dárců injikovali i.v. u třech nádorových modelů u myší: 1) U myší s injikovanými melanomovými a sarkomovými buňkami byly signifikantně inhibovány plicní metastázy a prodlouženo přežívání. 2) Stejná účinnost se projevila u SCID myší inokulovaných lidskými melanovými buňkami SK28 3) U myší, jimž byl melanom injikován do tlapek a po rozvoji nádoru amputována končetina s nádorem, byla snížena progrese tumoru a prodlouženo přežívání.

Autoři soudí, že Ig stimuluje protinádorový a antiangiogenní IL-12 a aktivitu NK buněk. Snad se nakonec prosadí i v prevenci a léčbě rozsevů lidských malignit?

Připraveno podle: G.R. Thrush et al.: Annu Rev Immunol 1996, 14, 49-71; M. Gadina et al.: Therap. Immunol. 1994, 1, 59-64; G. Hale a S. Cobbolt: BioMedNet, květen 1998, a dalších aktuálních zdrojů.